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染色質(zhì)免疫共沉淀(Chromatin Immunoprecipitation,ChIP)，是研究體內(nèi)蛋白質(zhì)與DNA相互作用的經(jīng)典方法。
想要獲得理想的ChIP結(jié)果，選擇適合的抗體固然很關(guān)鍵，ChIP 流程中所有步驟也很重要。本文對(duì)ChIP實(shí)驗(yàn)之前的準(zhǔn)備、獲得理想ChIP結(jié)果步驟、ChIP的qPCR定量分析和ChIP案例分析進(jìn)行總結(jié)，希望幫助到正在做ChIP實(shí)驗(yàn)和qPCR定量分析的您。
開(kāi)始 ChIP 之前要考慮三件事
（1）為您的實(shí)驗(yàn)查找適合的抗體
（2）優(yōu)化染色質(zhì)剪切
（3）評(píng)估您的 ChIP 實(shí)驗(yàn)?zāi)芊癯晒?
五個(gè)步驟獲得理想 ChIP 結(jié)果
Step1：交聯(lián)和裂解——穩(wěn)定復(fù)合物并分離核組分
第一步對(duì)時(shí)間要求嚴(yán)格并且需要優(yōu)化。體內(nèi)共價(jià)交聯(lián)穩(wěn)定蛋白質(zhì)-DNA相互作用并于特定時(shí)間點(diǎn)進(jìn)行分析。通常采用甲醛交聯(lián)，加入甘氨酸以終止反應(yīng)。交聯(lián)劑滲透到完整細(xì)胞中并將蛋白質(zhì)-DNA復(fù)合物鎖定在一起從而進(jìn)行分析。交聯(lián)劑在整個(gè)過(guò)程中保持復(fù)合物穩(wěn)定，但其作用必須是可逆的才能用于ChIP。一些非常穩(wěn)定的蛋白質(zhì)-DNA相互作用則不需要交聯(lián)。
接下來(lái)，使用裂解液透化細(xì)胞膜，釋放細(xì)胞組分，然后蛋白質(zhì)-DNA復(fù)合物變得可溶。去除細(xì)胞溶質(zhì)蛋白以減少背景信號(hào)并增加靈敏度。
注意：此時(shí)可以停止ChIP測(cè)定。 經(jīng)過(guò)交聯(lián)，淬滅和洗滌細(xì)胞沉淀后，將裂解物于-80℃儲(chǔ)存。
Step2：染色質(zhì)片段化——DNA片段化
細(xì)胞核材料片段化是獲得良好的ChIP 分辨率的關(guān)鍵因素，理想情況下的片段大小在 200 到 800 bp對(duì)之間。剪切是最難控制的步驟之一。通過(guò)超聲處理和/或核酸酶/酶促消化可以實(shí)現(xiàn)剪切，各有利弊。超聲處理需要大量的手動(dòng)操作時(shí)間，但非常適合難以裂解的細(xì)胞；酶促消化不需要手動(dòng)操作，適用于大量樣品的處理，但其剪切位點(diǎn)不是隨機(jī)的。兩種方法都需要根據(jù)具體細(xì)胞系進(jìn)行優(yōu)化。
注意：此時(shí)可以停止ChIP。經(jīng)過(guò)剪切/消化染色質(zhì)后，可以將樣品于-80°C儲(chǔ)存。避免反復(fù)凍融。
Step3：免疫沉淀——捕獲并分離蛋白質(zhì)-DNA復(fù)合物
使用抗體捕獲蛋白質(zhì)-DNA復(fù)合物中的目標(biāo)蛋白質(zhì)是實(shí)驗(yàn)成功的關(guān)鍵因素?？贵w免疫沉淀并從細(xì)胞核組分中分離蛋白質(zhì)，去除不相關(guān)的細(xì)胞物質(zhì)。
使用抗體結(jié)合磁珠完成所得抗體-蛋白質(zhì)-DNA復(fù)合物的純化。經(jīng)過(guò)孵育后，充分洗滌磁珠-抗體-蛋白質(zhì)-DNA復(fù)合物，純化并洗脫蛋白質(zhì)-DNA復(fù)合物。
Step4：制備DNA——解交聯(lián)和DNA純化
現(xiàn)在含有目標(biāo)蛋白質(zhì)的染色質(zhì)片段已分離，需要解交聯(lián)并純化DNA。解交聯(lián)通常采用高熱孵育和/或消化來(lái)完成。
注意：此時(shí)可以停止ChIP。經(jīng)過(guò)解交聯(lián)和/或DNA純化后，可以將樣品于-20°C儲(chǔ)存。
Step5：定量DNA——測(cè)定目標(biāo)蛋白質(zhì)-DNA水平
在該步驟中，通過(guò)qPCR定量純化的DNA產(chǎn)物，通過(guò)qPCR，您可以確定目標(biāo)蛋白是否存在于特定位點(diǎn)。
ChIP的qPCR如何定量分析
ChIP-qPCR 數(shù)據(jù)需要針對(duì)可變性來(lái)源進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化，包括染色質(zhì)數(shù)量、免疫沉淀的效率（富集效率）和 DNA 回收率。
兩種常用的標(biāo)準(zhǔn)化 ChIP-qPCR 數(shù)據(jù)方法——Percent Input法和富集倍數(shù)法（Fold Enrichmen）。與input相關(guān)的ChIP-qPCR數(shù)據(jù)包括ChIP的背景水平和input染色質(zhì)的標(biāo)準(zhǔn)化。建議ChIP 實(shí)驗(yàn)重復(fù)，盡可能將結(jié)果與背景信號(hào)和標(biāo)準(zhǔn)誤差一起顯示。
Percent Input法
使用這種方法，從ChIP獲得的信號(hào)除以從input樣本中獲得的信號(hào)。input樣本代表ChIP中使用的染色質(zhì)數(shù)量。通常1%的起始染色質(zhì)用作input。
示例：計(jì)算input百分比
注意：如果起始input為1%，則從稀釋input的Ct值中減去100或6.644 cycles（100的log2）的稀釋因子（DF）。
富集倍數(shù)法
這種標(biāo)準(zhǔn)化方法也稱(chēng)為“背景信號(hào)”或“相對(duì)無(wú)抗體對(duì)照”。該方法將ChIP 信號(hào)除以無(wú)抗體信號(hào)，將ChIP信號(hào)表示為信號(hào)相對(duì)于背景信號(hào)的倍數(shù)增加。該方法建立在背景信號(hào)的水平在不同的引物組、樣品和重復(fù)實(shí)驗(yàn)間可重復(fù)的假設(shè)上。背景信號(hào)水平在引物組、樣品和實(shí)驗(yàn)之間有所不同。
示例：富集倍數(shù)計(jì)算
ChIP案例分析
項(xiàng)目文章｜ChIP實(shí)驗(yàn)分析揭示H3K27me3去甲基化酶在體細(xì)胞重編程調(diào)控轉(zhuǎn)錄機(jī)制
2020年10月8日，中國(guó)科學(xué)院廣州生物醫(yī)藥與健康研究院/生物島實(shí)驗(yàn)室秦寶明教授團(tuán)隊(duì)和Miguel A. Esteban課題組在Nature Communications雜志發(fā)表了題為"JMJD3 acts in tandem with KLF4 to facilitate reprogramming to pluripotency"的研究論文，該成果揭示了H3K27me3去甲基化酶JMJD3與KLF4在體細(xì)胞重編程中協(xié)同調(diào)控轉(zhuǎn)錄新機(jī)制，深圳易基因提供本研究中的部分測(cè)序分析服務(wù)。
標(biāo)題：JMJD3 acts in tandem with KLF4 to facilitate reprogramming to pluripotency
發(fā)表時(shí)間：2020年10月8日
期刊：Nature Communications
影響因子：14.919
技術(shù)方法：ChIP-seq、RNA-seq、RT-qPCR等
作者通過(guò)對(duì)小鼠體細(xì)胞重編程過(guò)程中進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組和ChIP-seq等測(cè)序分析，揭示了H3K27me3去甲基化酶JMJD3與KLF4在體細(xì)胞重編程中協(xié)同調(diào)控轉(zhuǎn)錄新機(jī)制。首先，JMJD3對(duì)重編程有2方面相反的作用；在機(jī)制上，JMJD3被KLF4特異性地招募至上皮和多能性基因位點(diǎn)，并輔助KLF4激活這些基因。進(jìn)一步，作者還在多種其他KLF4介導(dǎo)的細(xì)胞命運(yùn)轉(zhuǎn)變中驗(yàn)證了JMJD3的這一作用模式。因此，本研究對(duì)深入理解KLF4和JMJD3在相關(guān)發(fā)育、干細(xì)胞分化、生理和疾病條件下的復(fù)雜作用具有提示意義。
關(guān)于染色質(zhì)免疫共沉淀測(cè)序技術(shù)（ChIP-Seq）
將ChIP與高通量測(cè)序技術(shù)相結(jié)合的ChIP-Seq技術(shù)，可在全基因組范圍對(duì)特定蛋白的DNA結(jié)合位點(diǎn)進(jìn)行高效而準(zhǔn)確的篩選與鑒定，為研究的深入開(kāi)展打下基礎(chǔ)。
不同組蛋白的差異性修飾與基因的轉(zhuǎn)錄、染色質(zhì)的空間構(gòu)型和構(gòu)象密切相關(guān)。運(yùn)用某一修飾的特定組蛋白的特異性抗體富集與其結(jié)合的DNA片段，并進(jìn)行純化和文庫(kù)構(gòu)建，然后進(jìn)行高通量測(cè)序，通過(guò)將獲得的數(shù)據(jù)與參考基因組精確比對(duì)，研究人員可獲得全基因組范圍內(nèi)某種修飾類(lèi)型的特定組蛋白與基因組DNA序列之間的關(guān)系，也可對(duì)多個(gè)樣品進(jìn)行差異比較。
技術(shù)優(yōu)勢(shì)：
（1）篩選范圍廣：全基因組范圍內(nèi)篩選特定組蛋白修飾與基因組DNA序列之間的關(guān)系
（2）微量樣本：只需5ng以上免疫沉淀后的DNA，即可展開(kāi)測(cè)序分析
（3）方案靈活：根據(jù)不同的項(xiàng)目需求，選擇不同的組蛋白修飾特異性抗體
參考：
1、 thermofisher
2、 doi.org/10.1038/s41467-020-18900-z
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