01.技術(shù)簡(jiǎn)述

R-loop是由DNA:RNA 雜交體和被置換的單鏈DNA組成的三鏈核酸結(jié)構(gòu)，廣泛參與基因轉(zhuǎn)錄、表觀遺傳調(diào)控及DNA修復(fù)等關(guān)鍵生物學(xué)過程。異常的R-loop積累會(huì)導(dǎo)致基因組不穩(wěn)定性，與癌癥、神經(jīng)退行性疾病及自身免疫性疾病密切相關(guān)。

技術(shù)痛點(diǎn)：傳統(tǒng)方法難以精準(zhǔn)區(qū)分R-loop與非特異性RNA結(jié)合，且無法解析其轉(zhuǎn)錄方向性。

02.R-loop研究解決方案

DRIP-seq

( DNA:RNA Hybrid Immunoprecipitation Sequencing）：基于S9.6抗體特異性識(shí)別RNA:DNA 雜交鏈，通過免疫沉淀富集R-loop區(qū)域，結(jié)合NGS測(cè)序?qū)崿F(xiàn)全基因組覆蓋。

優(yōu)勢(shì)：

? 高特異性：S9.6抗體精準(zhǔn)捕獲DNA:RNA 雜交體，避免假陽(yáng)性。

? 高靈敏度：高靈敏度定位全基因組R-loop分布。

?無酶干擾：不依賴內(nèi)切酶消化，保留天然R-loop結(jié)構(gòu)。

? 廣泛兼容性：適用于細(xì)胞、組織、血液、植物等多種樣本類型。

DRIPc-seq（DRIP with cDNA Sequencing）：

在DRIP-seq基礎(chǔ)上，對(duì)免疫沉淀的RNA鏈進(jìn)行cDNA建庫(kù)，明確R-loop中RNA來源鏈及轉(zhuǎn)錄方向。

R-loop CUT&Tag：

利用S9.6抗體引導(dǎo)Tn5轉(zhuǎn)座酶靶向切割R-loop區(qū)域，直接在DNA片段兩端添加測(cè)序接頭，無需免疫沉淀步驟。

03.典型案例

案例1

DRIP-seq+ChIP-seq揭示AMPK缺失導(dǎo)致的異常表觀遺傳修飾通過形成異常R-loop結(jié)構(gòu)影響基因組穩(wěn)定性，并導(dǎo)致生殖缺陷^[1]

期刊：Nucleic Acids Research

影響因子：IF 16.6    

樣本：秀麗隱桿線蟲（C. elegans）

本研究通過染色質(zhì)免疫共沉淀測(cè)序（ChIP-seq）和DNA:RNA免疫沉淀測(cè)序（DRIP-seq）聯(lián)合分析揭示了AMP激活蛋白激酶（AMPK）在饑餓條件下通過調(diào)控H3K4me3沉積和R-loop形成來維持基因組穩(wěn)定性和生殖細(xì)胞完整性的機(jī)制。AMPK缺失導(dǎo)致的異常表觀遺傳修飾和R-loop積累不僅影響當(dāng)前代，還會(huì)跨代傳遞，導(dǎo)致生殖缺陷和基因組不穩(wěn)定性。這些發(fā)現(xiàn)為理解環(huán)境應(yīng)激與表觀遺傳修飾之間的關(guān)系提供了新的見解，并可能對(duì)人類生殖健康和癌癥研究產(chǎn)生重要影響。

DRIP-seq和DRIPc-seq通過基于S9.6的DNA-RNA免疫沉淀高通量測(cè)序進(jìn)行高分辨率、鏈特異性R-loop定位^[2]

期刊：NATURE PROTOCOLS

影響因子：IF 13.1細(xì)胞

樣本：骨骼肌

本研究通過DRIP-seq和DRIPc-seq進(jìn)行R-loop定位，結(jié)果表明該技術(shù)可以檢測(cè)任何感興趣的基因組中R-loop結(jié)構(gòu)的穩(wěn)態(tài)分布。更重要的是，這些方法可用于由遺傳突變（基因敲除或敲低）或化學(xué)處理（藥物/激素）引起的整體R-loop分布或動(dòng)態(tài)變化。已發(fā)表的例子包括人乳腺癌細(xì)胞對(duì)雌激素轉(zhuǎn)錄誘導(dǎo)的反應(yīng)或沉默人HEK293細(xì)胞中DNA拓?fù)洚悩?gòu)酶1的后果。利用DRIPc-seq在小鼠細(xì)胞和酵母中成功地檢測(cè)到了R-loop譜。

04.

易基因項(xiàng)目經(jīng)驗(yàn)

05.參考文獻(xiàn)

① Sun B, Sherrin M, Roy R. Unscheduled epigenetic modifications cause genome instability and sterility through aberrant R-loops following starvation. Nucleic Acids Res. 2023 Jan 11;51(1):84-98. pii: 6887602. doi: 10.1093/nar/gkac1155. 

②Sanz LA, Chédin F. High-resolution, strand-specific R-loop mapping via S9.6-based DNA-RNA immunoprecipitation and high-throughput sequencing. Nat Protoc. 2019 Jun;14(6):1734-1755. pii: 10.1038/s41596-019-0159-1. doi: 10.1038/s41596-019-0159-1.