細胞游離DNA（cell-free DNA，cfDNA）是指在生物體的體液中（如血漿、尿液、腦脊液等）自由存在的、非細胞內(nèi)的DNA片段。這些DNA片段通常來源于細胞凋亡（程序性死亡）或壞死（細胞損傷或死亡后釋放），可以被釋放到循環(huán)系統(tǒng)中，并在體液中被檢測到。cfDNA研究和應用是精準醫(yī)療和液體活檢領域的重要方向之一。

cfDNA特點：來源多樣、片段短小、半衰期短、非侵入性檢測

cfDNA應用領域：腫瘤學、產(chǎn)前診斷、移植醫(yī)學、移植性疾病等

cfDNA檢測研究方案

1. 研究目標

• 確定cfDNA在特定疾?。ㄈ缒[瘤學、產(chǎn)前診斷等）早期篩查和診斷中的有效性和準確性。
• 識別和驗證疾病特異性的cfDNA甲基化和羥甲基化標記。
• 評估cfDNA組蛋白修飾在疾病早期診斷中的作用。

2. 研究設計

• 隊列選擇：選擇特定疾病高風險人群和健康對照組，確保樣本的代表性和多樣性。
• 樣本收集：收集血漿、尿液、腦脊液等樣本，并確保樣本的質量和存儲條件符合要求。

3. 檢測技術

• cfDNA甲基化檢測：使用cfDNA-RBS、cfWGBS、cfMeDIP-seq等技術進行甲基化模式分析。
• cfDNA羥甲基化檢測：采用ACE-seq和cfhMeDIP-seq技術進行羥甲基化水平分析。
• cfDNA組蛋白修飾檢測：利用cfChIP-seq技術研究組蛋白修飾水平。
• cfDNA基因突變檢測：通過WGS和WES技術檢測cfDNA基因組變異。

4. 數(shù)據(jù)分析

• 生物信息學分析：對測序數(shù)據(jù)進行質量控制、比對、變異檢測和甲基化水平分析。
• 統(tǒng)計分析：使用機器學習模型識別疾病特異性標記，并評估其診斷效能。

5. 驗證和臨床應用

• 驗證研究：在獨立隊列中驗證發(fā)現(xiàn)的生物標志物。
• 臨床應用：與臨床數(shù)據(jù)結合，評估cfDNA檢測在實際臨床診斷中的應用價值。

cfDNA檢測樣本選擇和送樣要求

樣本選擇

·     血漿樣本：血漿能避免所含血細胞裂解引起的DNA污染，是cfDNA檢測的優(yōu)先選擇。

·     腦脊液樣本：通常作為中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病研究的樣本選擇。

·     尿液樣本：常用于泌尿系統(tǒng)癌癥如膀胱癌、腎癌等腫瘤標志物研究及移植排異監(jiān)測等cfDNA研究。

血漿樣本要求

·     樣本采集：靜脈抽血5-10ml，收集到EDTA抗凝血管中，上下顛倒抗凝采血管，輕輕混勻，全血2-8℃保存不超過4h；如用Streck采血管收集全血，則5-8℃保存不超過72h。

·     分離血漿：采血后建議馬上分離血漿，提取cfDNA，-20℃保存；如不能馬上提取，常規(guī)采血管采血后必須4h內(nèi)（最好30min-1h內(nèi)）完成血漿分離，-80℃保存。

·     樣本運輸：大體積干冰運輸。

cfDNA研究案例
 （1）ctDNA全基因組亞硫酸鹽測序分析，用于癌癥檢測和分子分類
此研究納入三組乳腺癌（BC）患者（BC組n=123；健康對照組n=40），利用ctDNA-WGBS技術檢測從200μL血漿中獲得的微量ctDNA（輸入量約1ng）進行測序分析。研究結果發(fā)現(xiàn)，在多中心患者隊列中，在早期和晚期BC階段中對于15個ctDNA甲基化標志物的診斷特征表現(xiàn)出高準確性。同時可以在不同的癌癥類型（包括肝細胞癌和肺癌）中可以很好區(qū)分雌激素受體狀態(tài)的ctDNA甲基化特征。
 
圖：ctDNA甲基化可以作為乳腺癌亞型分類和預測ER狀態(tài)的潛在生物標志物[3]

  （2）MeDIP-seq結合機器學習方法，為多癌種生物標志物檢測提供新思路。
此研究通過結合cfMeDIP-seq技術和機器學習，分析了215例樣本的cfDNA甲基化組，包括患有肝癌或腦癌的個體樣本（實驗組）以及無癌癥個體樣本（對照組）。利用DMRs、DhMRs或DMRs+DhMRs訓練機器學習模型，結果發(fā)現(xiàn)DMRs+DhMRs聯(lián)合模型在區(qū)分對照組、肝癌和腦癌方面表現(xiàn)出更優(yōu)性能，研究支持同時利用DMRs和DhMRs進行多癌種檢測的潛力。
 
圖：用于分析血漿cfDNA甲基化的單鏈cfDNA甲基化DNA免疫沉淀測序方法[4]

（3）ACE-seq無需亞硫酸鹽轉化精準區(qū)分甲基化和羥甲基化標記
此研究建立一種利用DNA脫氨酶（APOBEC3A）實現(xiàn)的非破壞性的、低起始DNA量的鑒定5hmC技術（ACE-seq）。與傳統(tǒng)亞硫酸鹽測序（BS-Seq）不同，ACE-seq不依賴于亞硫酸鹽處理，而是通過酶促脫氨反應來區(qū)分未修飾的胞嘧啶（C）和5-甲基胞嘧啶（5mC），同時保護5hmC不被轉化為尿嘧啶。這種方法允許對cfDNA中的5hmC進行精確的定位和定量分析。
 
圖：幾類基因組元件的 5hmC（藍色）和 5mC（紅色）的修飾水平[2]

  （4）cfhMeDIP-seq對5-羥甲基胞嘧啶（5hmC）特征進行檢測以預測早期胰腺癌
此研究利用cfDNA hMeDIP-seq對胰腺導管腺癌（PDAC）隊列（n=64）與非癌癥隊列（n=243）的5hmC變化進行比較分析。在數(shù)千個基因中鑒定差異性羥甲基化，結果表明胰腺發(fā)育或功能相關基因和癌癥發(fā)病機制相關基因差異最為顯著。在PDAC隊列的cfDNA羥甲基化組中，與KRAS激活和TP53失活在PDAC腫瘤中常見基因調控失調相關的基因表現(xiàn)出差異性富集，表明5hmC變化在早期疾病階段能實現(xiàn)PDAC分類。
 
圖：與非癌癥患者cfDNA相比，PDAC cfDNA中的5hmC占位差異分析[5]

  （5）cfChIP-seq利用cfDNA片段分析組蛋白修飾，揭示H3K27ac水平與cfDNA片段大小有關
此研究利用cfChIP-seq檢測技術從18個健康對照樣本中獲得H3K27ac信號，并結合配對樣本分析循環(huán)核小體的cfDNA片段大小模式和H3K27ac信號之間的相關性。隨后構建線性回歸模型，可根據(jù)cfDNA片段大小模式推斷血漿中H3K27ac水平（H3K27ac相關信號）。分析發(fā)現(xiàn)H3K27ac相關信號與cfChIP-seq測定的H3K27ac相關信號一致。
 
圖：cfChIP-seq揭示H3K27ac水平與cfDNA片段大小之間的關系[7]

(6) cfDNA低覆蓋度WGS揭示腫瘤患者的全基因組突變特征
此研究對215名患者和227名健康人群的血漿進行全基因組測序（WGS），鑒定出病理性和生理性突變特征。
 
圖：多種癌癥類型的血漿基因突變特征檢測[6]

參考文獻：
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⑥ Wan JCM, et al. Genome-wide mutational signatures in low-coverage whole genome sequencing of cell-free DNA. Nat Commun. 2022 Aug 23;13(1):4953. pii: 10.1038/s41467-022-32598-1. doi: 10.1038/s41467-022-32598-1. PubMed PMID: 35999207.
⑦ Bai J, et al. Histone modifications of circulating nucleosomes are associated with changes in cell-free DNA fragmentation patterns. Proc Natl Acad Sci U S A. 2024 Oct 15;121(42):e2404058121. doi: 10.1073/pnas.2404058121. PubMed PMID: 39382996.