甲基化-全基因組甲基化測序（WGBS）
全基因組重亞硫酸鹽甲基化測序（WGBS）可以在全基因組范圍內(nèi)精確的檢測所有單個胞嘧啶堿基（C堿基）的甲基化水平，是DNA甲基化研究的金標準。WGBS能為基因組DNA甲基化時空特異性修飾的研究提供重要技術(shù)支持，能廣泛應用在個體發(fā)育、衰老和疾病等生命過程的機制研究中，也是各物種甲基化圖譜研究的首選方法。
全基因組甲基化測序技術(shù)通過T4-DNA連接酶，在超聲波打斷基因組DNA片段的兩端連接接頭序列，連接產(chǎn)物通過重亞硫酸鹽處理將未甲基化修飾的胞嘧啶C轉(zhuǎn)變?yōu)槟蜞奏，進而通過接頭序列介導的 PCR 技術(shù)將尿嘧啶U轉(zhuǎn)變?yōu)樾叵汆奏。
應用方向
WGBS廣泛用于各種物種，要求全基因組掃描（不錯過關(guān)鍵位點）
1）全基因組甲基化圖譜課題
2）標志物篩選課題
3）小規(guī)模研究課題
技術(shù)優(yōu)勢
1）應用范圍廣：適用于所有參考基因組已知物種的甲基化研究；
2）全基因組覆蓋：最大限度地獲取完整的全基因組甲基化信息，精確繪制甲基化圖譜；
3）單堿基分辨率：可精確分析每一個C堿基的甲基化狀態(tài)。
技術(shù)路線
實驗策略
送樣要求
技術(shù)指標
DNA甲基化檢測技術(shù)特點：
1）450K/850：該技術(shù)針對基因組上已知的約450K和850K個重要的CpG位點進行芯片掃描檢測，準確性、可重復性較高，缺點是只能用于人類樣本，且無法對基因組上芯片之外新的CpG位點進行檢測。
技術(shù)選擇
經(jīng)典案例
醫(yī)學方向：
Whole-Genome Bisulfite Sequencing of Two Distinct Interconvertible DNA Methylomes of Mouse Embryonic Stem Cells. 兩種狀態(tài)的小鼠胚胎干細胞的甲基化組學研究
背景
小鼠胚胎干細胞一般生長在含有血清的基質(zhì)中，被稱作血清干細胞(serum ESCs)；加兩種激酶抑制因子使胚胎干細胞在無血清的情況下更能保持多能性的基態(tài)，這種干細胞稱為2i干細胞(2i ESCs)；這兩種狀態(tài)的胚胎干細胞可以互相轉(zhuǎn)化。以前這方面的甲基化研究大多基于質(zhì)譜，覆蓋度和研究結(jié)果有限，尚缺乏2i胚胎干細胞的甲基化組學研究。
方法
利用全基因組重亞硫酸鹽甲基化測序（WGBS），對這兩種可互相轉(zhuǎn)換的小鼠胚胎干細胞進行甲基化組學研究
結(jié)論
全面準確的檢測了兩種小鼠胚胎干細胞的DNA甲基化修飾并進行了系統(tǒng)的比較；同serum ESCs相比，雄性2iESCs全局低甲基化；在血清中，雌性ESCs跟雄性2i ESCs類似呈現(xiàn)全局低甲基化，而在2i ESCs狀態(tài)下，甲基化水平會進一步降低。
不同狀態(tài)下小鼠胚胎干細胞的甲基化修飾比較
農(nóng)學方向：
Global increase in DNA methylation during orange fruit development and ripening（甜橙果實發(fā)育和成熟過程中全基因組DNA甲基化增加）
背景
DNA甲基化是參與許多生物過程的重要表觀遺傳標記。已有研究表明，番茄在成熟過程中全基因組DNA甲基化會顯著降低，但其他水果的成熟是否與全基因組DNA去甲基化有關(guān)還尚不清楚。
方法
紐荷爾甜橙(Citrus Sinensis Osbeck)果實，采集了開花后90、120、150、180和210d的五個不同發(fā)育階段的果實。采集橙果皮，并保存在-80°C，用于DNA和RNA的提取。
結(jié)果
作者鑒定了甜橙果實的單堿基分辨DNA甲基化情況。與未成熟的甜橙果實相比，成熟的甜橙果實在3萬多個基因組區(qū)域獲得了DNA甲基化，在大約1000個基因組區(qū)域失去DNA甲基化，這表明在甜橙果實成熟過程中全基因組DNA甲基化顯著增加。DNA甲基化的增加與DNA去甲基酶基因表達的降低有關(guān)。DNA甲基化抑制劑的應用干擾了甜橙果實的成熟，這表明DNA高甲基化是甜橙果實能夠正常成熟的關(guān)鍵。作者發(fā)現(xiàn)，成熟相關(guān)的DNA高甲基化與數(shù)百個基因(如光合作用基因)的抑制和數(shù)百個基因(包括與脫落酸反應有關(guān)的基因)的激活有關(guān)。作者的結(jié)果表明DNA甲基化在甜橙果實成熟過程中起著重要作用。
甜橙果實發(fā)育和成熟期間全基因組DNA甲基化增加
參考文獻：
1）Ehsan Habibi, et al. Whole-Genome Bisulfite Sequencing of Two Distinct Interconvertible DNA Methylomes of Mouse Embryonic Stem Cells. Cell Stem Cell (2013), 13(3), 360-369.
2）Huang H, et al. Global increase in DNA methylation during orange fruit development and ripening. Proc Natl Acad Sci U S A. 2019 Jan 22;116(4):1430-1436.
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