植物內(nèi)生菌中可培養(yǎng)的微生物種類十分有限,宏基因組學(xué)(metagenomics)是研究植物內(nèi)生菌的有效手段之一。植物內(nèi)生菌宏基因組研究通過不依賴于純培養(yǎng)的宏基因組學(xué)(metagenomics)研究方法,構(gòu)建植物內(nèi)生菌的宏基因組文庫,并從該文庫中直接篩選獲得生物合成基因簇,進一步鑒定其功能, 對植物內(nèi)生菌進行定性及定量分析，為植物的微生物起源提供直接的證據(jù)。

技術(shù)優(yōu)勢：

超深度檢測：提取的全宏基因組DNA建立隨機小片段文庫，避免了目的片段的PCR過程，降低bias，隨機測序，獲取更豐富的序列信息。

植物組織表面菌處理：通過實驗方法去除植物外表面菌株污染，準(zhǔn)確測序植物內(nèi)生菌種類、豐富及互作關(guān)系，真實還原構(gòu)建微生態(tài)系統(tǒng)的功能網(wǎng)絡(luò)。

16S全長檢測：植物內(nèi)生菌提取DNA后，通過16S全長擴增，質(zhì)控內(nèi)生菌提取效果。

實驗策略：

信息分析：

樣本要求：

研究案例：

病原菌介導(dǎo)植物內(nèi)生菌群抑病功能的激活

Carrión VJ,et al.Pathogen-induced activation of disease-suppressive functions in the endophytic root microbiome. Science. 2019 Nov 1;366(6465):606-612.

1、背景：

植物微生物組研究已經(jīng)積累了大量的測序數(shù)據(jù)和豐富的信息，表明了許多植物根際、葉際、種子和胚層中不同微生物群落的多樣性和豐富度。然而迄今為止，很少有研究論證微生物組對特定植物表型（即植物生長、發(fā)育和健康）的功能影響。因此，在分子和化學(xué)層面上許多植物表型與微生物組結(jié)構(gòu)和功能之間在的因果關(guān)系仍然未知。本研究旨在探討植物內(nèi)生微生物菌群（植物內(nèi)生菌）的基因多樣性及對真菌感染植株的保護作用。

2、方法：

為了解生活在植物根組織中的植物內(nèi)生菌的抑病功能，作者對生長在抑病土壤中的甜菜幼苗根內(nèi)進行宏基因組測序分析；并鑒定與抑病相關(guān)的微生物群落和功能組成，以區(qū)分哪些生物合成基因簇（BGCs）在感染過程中上調(diào)，然后重組內(nèi)生菌群；最后進行位點定向突變，檢測特異性BGCs是否在抑病過程中起著重要作用。

3、結(jié)論：

本研究中，植物內(nèi)生菌的宏基因組學(xué)研究和網(wǎng)絡(luò)推論表明，植物根部的真菌感染在根內(nèi)Chitinophagaceae和Flavobacteriaceae富集；同時，幾丁質(zhì)酶基因、編碼非核糖體肽合成酶（nonribosomal peptide synthetases，NRPSs）和聚酮合成酶（polyketide synthases，PKSs）產(chǎn)生的各種未知生物合成基因簇。在菌株基因組重建后，由Chitinophagaceae和Flavobacteriaceae合成的菌群持續(xù)抑制真菌根部疾病。定點誘變表明，黃桿菌中此前未鑒定的NRPS-PKS基因簇對內(nèi)生菌群抑病至關(guān)重要。研究結(jié)果表明，內(nèi)生根微生物組（植物內(nèi)生菌）具有許多尚不為人所知的功能性狀，可以共同保護植物內(nèi)外。

圖：內(nèi)生菌群落生物合成基因簇的多樣性和分布

參考文獻：
① Carrión VJ,et al.Pathogen-induced activation of disease-suppressive functions in the endophytic root microbiome. Science. 2019 Nov 1;366(6465):606-612.